科研进展

Brugada综合征（BrS）是一种罕见性的心脏离子通道病，临床上以右胸导联（V1-V3）ST段呈下斜型或马鞍型抬高、心脏结构无明显异常、恶性心律失常和晕厥反复发作、心源性猝死（SCD）为特征。该病引起的猝死占所有猝死病例的4%，占无器质性心脏疾病猝死者的20%。更为严重的是，大多数患者发生的第一症状就是猝死，根本来不及防范和救治。植入埋藏式自动心脏复律除颤器（ICD）是惟一可预防BrS患者SCD的手段。BrS为常染色体显性遗传病，目前已发现多个致病基因，但其致病机制并不清楚。

2022年2月21日，浙565net必赢最新版首页官网转化医学研究院/浙565net必赢最新版首页官网附属第一医院梁平教授团队在Clinical and Translational Medicine杂志在线发表Hyperactivation of platelet-derived growth factor signaling contributes to arrhythmogenesis in Brugada syndrome的研究论文。该研究发现了TRPM4相关Brugada综合征（TRPM4-related BrS）的新机制以及潜在治疗靶点。

研究团队招募了一名21岁的男性BrS患者，该患者超声心动图未见异常，但心电图表现为特征性BrS波，V2导联ST段呈马鞍型抬高。基因检测发现该患者携带离子通道基因TRPM4的错义突变（c.785C>T; p.T262M），该突变位于TRPM4通道N端，在哺乳动物中高度保守。该突变的变异评级为临床意义未明（variant of uncertain significance, VUS）。 

图1. BrS患者临床特征

研究者对BrS患者以及同时招募的一

21岁健康受试者（正常人对照）皮肤活检后进行皮肤成纤维细胞的分离、培养和扩增，随后应用非整合型仙台病毒进行体细胞重编程建立诱导多能干细胞（iPSC），并应用心肌定向分化技术获得正常人和BrS患者特异的iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。单细胞膜片钳记录显示正常人组iPSC-CMs中呈现均匀、节律性的动作电位；然而，在很大比例的患者组iPSC-CMs中出现了心律失常表型，具体表现为两种形式：一种是较为常见的延迟后除极（DAD），另一种是相对罕见但更为严重的阵发性细胞颤动（PCF）。此外，研究者在患者组iPSC-CMs中观察到了心律不齐以及动作电位时程（APD）显著缩短。为了获得更为严格的对照进行更加精确的功能学比较，研究者应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行了T262M突变的定点矫正，成功获得了等基因型（isogenic）的基因矫正组（gene-corrected, GC）iPSC细胞株。随即分化的矫正组iPSC-CMs恢复了正常的动作电位特征，与对照组心肌细胞相似。此外，研究者还应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行了正常人iPSC的TRPM4基因敲除（KO），结果显示敲除组iPSC-CMs重现了心律失常表型和异常的动作电位特征，与BrS患者组心肌细胞相似。以上结果提示了T262M是导致心律失常表型的致病突变。

图2. TRPM4 T262M导致BrS患者iPSC-CMs心律失常表型

接下来，研究者对受累基因TRPM4进行了系统性的功能研究。在HEK293T细胞中分别过表达野生型（WT）和T262M突变型TRPM4通道，并通过全细胞（whole-cell）膜片钳和生物素标记的膜蛋白表达实验发现：T262M组TRPM4电流密度显著减小，TRPM4总蛋白和膜蛋白均显著减低，但膜蛋白与总蛋白的比例（膜蛋白/总蛋白）保持不变。在iPSC-CM模型中进行内源性TRPM4通道的蛋白表达检测发现：患者组心肌细胞的TRPM4蛋白表达显著低于正常人组和矫正组心肌细胞，而敲除组心肌细胞中几乎没有TRPM4通道表达。此外，研究者应用内膜向外式（inside-out）膜片钳记录发现了T262M引起TRPM4通道对钙离子的敏感性显著减低。以上结果提示了T262M突变导致了TRPM4通道的功能受损。

图3. T262M导致TRPM4通道功能受损

钙信号异常是心律失常发生的常见诱因，而钙信号在BrS致心律失常机制中的作用越来越受到关注。研究者应用比率钙成像技术检测iPSC-CMs中的钙瞬变发现，患者组iPSC-CMs中出现了心律失常样的钙瞬变特征和钙超载表型，而这一变化并没有在矫正组iPSC-CMs中观察到。有趣的是，患者组iPSC-CMs中L型钙通道电流密度显著增大，而给予L型钙通道阻断剂维拉帕米治疗（100 nM，20天）能够有效逆转患者组iPSC-CMs中的心律失常和钙超载表型。

为了探究TRPM4 T262M引起心律失常的分子机制，研究者进行了正常人组、敲除组、矫正组和BrS患者组iPSC-CMs的转录组测序。GO分析显示差异表达基因在离子通道、钙信号、心脏动作电位和传导、以及血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）信号等词条中富集。有趣的是，研究者发现血小板源性生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptor B, PDGFRB）在敲除组和患者组iPSC-CMs中显著上调。既往研究报道了PDGFRB信号通路调控心肌细胞增殖和再生、PDGFRB信号的过度激活与房颤和扩张性心肌病密切相关。研究者通过PDGFRB抑制剂或小干扰RNA（siRNA）等手段下调 PDGFRB水平后发现，患者组iPSC-CMs的钙超载和心律失常表型得到了明显恢复。因此，PDGFRB信号的异常激活是TRPM4 T262M突变导致心律失常发生的可能机制。

图4. 抑制PDGFRB活性有效逆转BrS患者iPSC-CMs中的心律失常和钙超载表型

综上所述，这项研究证实了临床筛查中发现的TRPM4基因突变（c.785C>T; p.T262M）可导致BrS的发生，应用iPSC-CM模型结合基因组编辑技术为该VUS位点的致病性鉴定提供了扎实的功能学依据。该研究发现了TRPM4相关BrS的新机制和潜在治疗靶点。

浙565net必赢最新版首页官网转化医学研究院博士生王洪坤和浙565net必赢最新版首页官网基础565net必赢最新版首页官网博士生徐丽臻为论文的共同第一作者，浙565net必赢最新版首页官网转化医学研究院/浙565net必赢最新版首页官网附属第一医院梁平教授为论文的通讯作者。同时，这项研究获得了浙565net必赢最新版首页官网基础565net必赢最新版首页官网杨帆研究员、浙565net必赢最新版首页官网基础565net必赢最新版首页官网祁鸣教授、温州医科大学附属第一医院黄周青教授、浙565net必赢最新版首页官网生命科学学院余路阳教授、杭州市妇产科医院王昊副主任医师、浙江省人民医院韩帅主治医师的大力支持。